二甲双胍单用或联合compound C 对小鼠4T1乳腺癌细胞增殖和细胞周期蛋白D1 表达的影响

doi:10.3877/cma. j. issn.1674-0807.2014.04.007

目的

研究二甲双胍及单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂(compound C)对体外培养的小鼠乳腺癌4T1 细胞株增殖抑制及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达的影响,进一步探索AMPK 通路在二甲双胍抗肿瘤的可能作用。

方法

体外培养小鼠乳腺癌4T1 细胞株至对数生长期,分别以2.5、5、10、20、40 mmol/L 二甲双胍及20 μmol/L compound C 对其进行单一或10 mmol/L 二甲双胍联合20 μmol/L compound C 干预24、48、72 h。应用CCK-8 方法检测不同浓度的二甲双胍、20 μmol/L compound C、20 μmol/L compound C+10 mmol/L 二甲双胍对该细胞株增殖的抑制情况; Western blot 法检测各组细胞内cyclin D1 的表达情况。多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用q 检验,治疗前后用重复测量数据资料的方差分析。

结果

CCK-8 法结果显示在体外细胞培养实验中2.5 mmol/L 二甲双胍组作用于该细胞株24、48 h 后分别和正常对照组比较,细胞存活率差异无统计学意义(24 h: F=2.87, P=0.129;48 h:F=1.63, P=0.290),作用72 h 后, 差异有统计学意义(F=6.40, P=0.000)。 5、10、20、40 mmol/L 二甲双胍组作用于该细胞株24、48、72 h 后,该细胞株的增殖被显著抑制(均P=0.000),且抑制程度随着药物浓度的增大(F=332.89、363.54、352.11,P 均=0.000)及作用时间的延长而逐渐增强,compound C 单独处理组及10 mmol/L 二甲双胍联合20 μmol/L compound C 处理细胞24、48、72 h 后,细胞存活率与正常对照组相比较,差异无统计学意义(F=1.08,P=2.283; F=1.92, P=0.050)。 Western blot 结果显示随着二甲双胍浓度的增加,各组细胞cyclin D1 表达水平逐渐降低(F=54.41、61.69、75.84, P 均=0.000),10 mmol/L 二甲双胍联合20 μmol/L compound C 作用时,与正常对照组比较,cyclin D1 表达水平无明显变化(F=1.87, P=0.190)。

结论

二甲双胍可以抑制小鼠乳腺癌4T1 细胞的增殖; compound C 可以拮抗二甲双胍的抑制作用;二甲双胍通过激活小鼠乳腺癌4T1 细胞内AMPK,下调cyclin D1 蛋白表达。

关键词: 二甲双胍, 乳腺肿瘤, 4T1 细胞, 细胞周期蛋白D1

Objective

To evaluate the effects of metformin alone or in combination with AMPK inhibitor compound C on proliferation and cyclin D1 expression in mouse breast cancer 4T1 cells and explore the possible role of AMPK pathway in the antitumor mechanism of metformin.

Methods

The mouse breast cancer 4T1 cells were cultured in vitro until the logarithm growth period, and then treated with 2.5, 5, 10, 20,40 mmol/L metformin and 20 μmol/L compound C respectively and 20 μmol/L compound C combined with 10 mmol/L metformin for 24,48,72 h. CCK-8 method was used to study the effects of metformin with different concentrations,20 μmol/L compound C+10 mmol/L metformin, 20 μmol/L compound C on cell proliferation.The expression of cyclinD1 was detected with Western blot method. Multiple group comparison was performed by F test, pairwise comparison by q test, analysis of variance for repeated measurement data before and after treatment.

Results

CCK-8 test showed that in vitro cell culture, at 24, 48 h after 2.5 mmol/L metformin treatment, there was no significant difference in cell survival compared with control group(24 h:F=2.87,P=0.129;48 h:F=1.63, P=0.290), but a significant difference was observed at 72 h (F=6.40, P=0.000).at 24,48 and 72 h after 5,10,20,40 mmol/L metformin treatment, the proliferation of mouse breast cancer 4T1 cells was significantly inhibited by metformin in a dose-dependent and time-dependent manner(F=332.89,363.54,352.11, all P=0.000). Meanwhile in compound C group and 10 mmol/L metformin plus compound C group, cell survival showed no significant difference compared with the control group(F=1.08, P=2.283;F=1.92,P=0.050). The results in Western blot analysis, the expression of cyclin D1 decreased with the increase of metformin concentration (F=54.41, 61.69, 75.84, all P=0.000), but showed no significant difference(F=1.87, P=0.190) between 10 mmol/L metformin plus compound C group and control group.

Conclusions

Metformin can inhibit the cell proliferation of mouse breast cancer 4T1 cells, but compound C can antagonize the inhibition of metformin. Metformin can decrease cyclin D1 protein expression by activating AMPK pathway in mouse breast cancer 4T1 cells.

Key words: Metformin, Breast neoplasms, 4T1 cells, Cyclin D1

表1 不同浓度二甲双胍作用不同时间后各组乳腺癌4T1 细胞的存活率比较

组别	存活率			合计	F值	P值
组别	24 h	48 h	72 h	合计	F值	P值
组2	1	1	1	1	0	1
组3	0.97±0.04	0.86±0.05	0.81±0.06	0.88±0.08	41.55	0.000
组4	0.65±0.03	0.64±0.04	0.59±0.03	0.63±0.04	5.21	0.008
组5	0.57±0.02	0.54±0.01	0.52±0.01	0.55±0.02	3.77	0.028
组6	0.53±0.01	0.47±0.01	0.47±0.01	0.49±0.03	9.87	0.000
组7	0.50±0.02	0.40±0.01	0.40±0.01	0.43±0.05	21.05	0.000
合计	0.70±0.02	0.65±0.03	0.63±0.03	0.66±0.05	273.79^a	0.000^a
F值	332.89	363.54	352.11	2193.07^a	30.01^b
P值	0.000	0.000	0.000	0.000^a	0.000^b

表1 不同浓度二甲双胍作用不同时间后各组乳腺癌4T1 细胞的存活率比较

组别	存活率			合计	F值	P值
组别	24 h	48 h	72 h	合计	F值	P值
组2	1	1	1	1	0	1
组3	0.97±0.04	0.86±0.05	0.81±0.06	0.88±0.08	41.55	0.000
组4	0.65±0.03	0.64±0.04	0.59±0.03	0.63±0.04	5.21	0.008
组5	0.57±0.02	0.54±0.01	0.52±0.01	0.55±0.02	3.77	0.028
组6	0.53±0.01	0.47±0.01	0.47±0.01	0.49±0.03	9.87	0.000
组7	0.50±0.02	0.40±0.01	0.40±0.01	0.43±0.05	21.05	0.000
合计	0.70±0.02	0.65±0.03	0.63±0.03	0.66±0.05	273.79^a	0.000^a
F值	332.89	363.54	352.11	2193.07^a	30.01^b
P值	0.000	0.000	0.000	0.000^a	0.000^b

图1 不同浓度二甲双胍对小鼠乳腺癌4T1 细胞存活率的影响

表2 二甲双胍联合compound C 对小鼠乳腺癌4T1 细胞增存活率的影响

组别	存活率			合计	F值	P值
组别	24 h	48 h	72 h	合计	F值	P值
组2	1	1	1	1	0	1
组8	0.99±0.03	0.99±0.03	0.95±0.04	0.98±0.04	1.03	0.366
组9	0.97±0.03	0.96±0.01	0.92±0.15	0.95±0.09	1.64	0.205
组10	0.63±0.01	0.58±0.05	0.47±0.02	0.56±0.07	12.30	0.000
合计	0.86±0.17	0.85±0.19	0.78±0.24	0.83±0.06	28.43^a	0.000^a
F值	60.38	76.47	112.40	866.72^{^a}	7.88^b
P值	0.000	0.000	0.000	0.000^a	0.000^b

表2 二甲双胍联合compound C 对小鼠乳腺癌4T1 细胞增存活率的影响

组别	存活率			合计	F值	P值
组别	24 h	48 h	72 h	合计	F值	P值
组2	1	1	1	1	0	1
组8	0.99±0.03	0.99±0.03	0.95±0.04	0.98±0.04	1.03	0.366
组9	0.97±0.03	0.96±0.01	0.92±0.15	0.95±0.09	1.64	0.205
组10	0.63±0.01	0.58±0.05	0.47±0.02	0.56±0.07	12.30	0.000
合计	0.86±0.17	0.85±0.19	0.78±0.24	0.83±0.06	28.43^a	0.000^a
F值	60.38	76.47	112.40	866.72^{^a}	7.88^b
P值	0.000	0.000	0.000	0.000^a	0.000^b

图2 二甲双胍联合或不联合compound C 对小鼠乳腺癌4T1 细胞存活率的影响

图3 不同浓度二甲双胍处理细胞不同时间后cyclin D1蛋白表达情况比较 1:正常对照组;2:5 mmol/L 二甲双胍组;3:10 mmol/L 二甲双胍组;4:20 mmol/L 二甲双胍组

图4 不同浓度二甲双胍对小鼠乳腺癌4T1 细胞作用不同时间后cyclin D1 相对表达量比较

表3 Western blot 检测不同浓度二甲双胍处理细胞后cyclin D1 的表达情况

组别	cyclin D1相对表达量			合计	F值	P值
组别	24 h	48 h	72 h	合计	F值	P值
组2	0.74±0.04	0.70±0.01	0.69±0.01	0.71±0.03	4.63	0.020
组4	0.64±0.01	0.60±0.01	0.54±0.01	0.60±0.04	16.84	0.000
组5	0.58±0.01	0.53±0.03	0.48±0.01	0.53±0.05	11.23	0.000
组6	0.53±0.02	0.49±0.01	0.45±0.01	0.49±0.04	17.41	0.000
合计	0.62±0.08	0.58±0.09	0.54±0.09	0.58±0.04	191.00^a	0.000^a
F值	54.41	61.69	75.84	732.39^a	4.38^b
P值	0.000	0.000	0.000	0.000^a	0.000^b

表3 Western blot 检测不同浓度二甲双胍处理细胞后cyclin D1 的表达情况

组别	cyclin D1相对表达量			合计	F值	P值
组别	24 h	48 h	72 h	合计	F值	P值
组2	0.74±0.04	0.70±0.01	0.69±0.01	0.71±0.03	4.63	0.020
组4	0.64±0.01	0.60±0.01	0.54±0.01	0.60±0.04	16.84	0.000
组5	0.58±0.01	0.53±0.03	0.48±0.01	0.53±0.05	11.23	0.000
组6	0.53±0.02	0.49±0.01	0.45±0.01	0.49±0.04	17.41	0.000
合计	0.62±0.08	0.58±0.09	0.54±0.09	0.58±0.04	191.00^a	0.000^a
F值	54.41	61.69	75.84	732.39^a	4.38^b
P值	0.000	0.000	0.000	0.000^a	0.000^b

表4 Western blot 检测二甲双胍联合或不联合compound C 处理细胞后cyclin D1 的表达情况

组别	cyclin D1相对表达量			合计	F值	P值
组别	24 h	48 h	72 h	合计	F值	P值
组2	0.76±0.01	0.74±0.00	0.69±0.01	0.73±0.03	67.28	0.000
组8	0.74±0.01	0.73±0.01	0.68±0.00	0.72±0.03	51.26	0.000
组9	0.74±0.01	0.73±0.00	0.68±0.00	0.72±0.03	51.10	0.000
组10	0.63±0.01	0.59±0.01	0.50±0.01	0.57±0.06	221.34	0.000
合计	0.72±0.05	0.70±0.07	0.64±0.08	0.66±0.05	346.90^a	0.000^a
F值	172.05	280.62	421.60	844.88^a	14.69^b
P值	0.000	0.000	0.000	0.000^a	0.000^b

表4 Western blot 检测二甲双胍联合或不联合compound C 处理细胞后cyclin D1 的表达情况

组别	cyclin D1相对表达量			合计	F值	P值
组别	24 h	48 h	72 h	合计	F值	P值
组2	0.76±0.01	0.74±0.00	0.69±0.01	0.73±0.03	67.28	0.000
组8	0.74±0.01	0.73±0.01	0.68±0.00	0.72±0.03	51.26	0.000
组9	0.74±0.01	0.73±0.00	0.68±0.00	0.72±0.03	51.10	0.000
组10	0.63±0.01	0.59±0.01	0.50±0.01	0.57±0.06	221.34	0.000
合计	0.72±0.05	0.70±0.07	0.64±0.08	0.66±0.05	346.90^a	0.000^a
F值	172.05	280.62	421.60	844.88^a	14.69^b
P值	0.000	0.000	0.000	0.000^a	0.000^b

图5 二甲双胍联合或不联合compound C 处理后不同时间cyclin D1 蛋白的表达比较 1: 正常对照组,2: 10 mmol/L 二甲双胍组; 3:20 μmol/L compound C 组;4: 10 mmol/L 二甲双胍+20 μmol/L compound C联合作用组

图6 二甲双胍联合或不联合compound C 对小鼠乳腺癌4T1 细胞作用不同时间后cyclin D1 的相对表达量

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Effects of metformin alone or in combination with compound C on proliferation and cyclinD1 expression in mouse breast cancer 4T1 cells

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